10h55 : Suite a certain éclaircissement sur le déroulement des manip, j’ai constaté avoir fait qq erreurs dans la conceptions de la base. outre le fait d’”avoir oublié les info pour conserver les info minimal sur les puces, j’ai mal compris la notion de manip, notamment quand 3 couleurs sont utilisées sur une lame.
le déroulement de la manip est le suivant
- construction de souches appat (bait)
- Obtention des doubles mutants
- Marquage de l’ADN avec les fluorophores
- obtention des rapports bait/control
- comparaison avec autre date
6 nouvelles souches (A, B, C, D E, F) par ex : delta-EDC3, delta-pex22, …
6 cultures de cellules dans les lesquelles on va obtenir 4700 doubles mutants en 18 générations
on réalise aussi 2 cultures de références (R1 et R2) YFR-Delta et YEL-Delta à partir desquelles on va obtenir aussi 4700 doubles mutants.
tous ces double mutants sont obtenus le meme jour et seront identifié par la date –> mating date
on marque une souche avec l’un des marqueurs fluo, par ex Cy3, une autre avec un autre marqueur, Cy5, et une référence marquée par alexa594. ces 3 souches marquées sont alors hybridées sur une lame.
on réalise ainsi 6 lames en croisant les souches et les références de façon que chaque souche soit présente sur 2 lames différentes et que la référence pour ces 2 lames soit à chaque fois différente. De plus il est également interessant de marquer la meme souche avec 2 marqueurs différent pour chacune des hybridations.
avec les souche A, B, C, D, E, F, et les références R1 et R2, on peut alors effectuer le croisement suivant :
lame 1 –> A-Cy3, B-Cy5, R1-Alexa594
lame 2 –> C-Cy3, A-Cy5, R2-Alexa594
lame 3 –> B-Cy3, D-Cy5, R2-Alexa594
lame 4 –> E-Cy3, C-Cy5, R1-Alexa594
lame 5 –> D-Cy3, F-Cy5, R1-Alexa594
lame 6 –> F-Cy3, E-Cy5, R2-Alexa594
on va alors calculer tous les rapport A/R1, A/R2, B/R1…F/R2
centrer les données, filtrer (SNR, diametre), eliminer les pics, puis combiner les résultats. pour chaque gène 4 spots existe sur la puce. on va garder la moyenne ou la médiane. ca reste a déterminer.
ces manip seront répétées un mois plus tard. les résultats seront comparés entre eux
il faut donc repenser la base en fonction de ces nouvelles infos. le terme de manip (ou experiment) va regrouper non pas une lame mais les couples appat/référence, la référence pourvant etre différente a chaque fois. une manip est donc principalement identifiée par son appat.
–> Rq : dans le cas de lame 2 couleurs, un couple appat/ref correspond bien a une lame
la hierarchie logique est donc la suivante:bait --> mating date --> hybridization avec en général pour un appat 2 cultures a des dates différentes et pour chacune de ces cultures 2 hybridations
20h14 : j’ao fini une première version complete de la base.
elle comprend 5 parties correspondant aux 5 éléments décrit par le format MIAME. une partie sur le array design pour contenir les info de construction des puce et 4 partie sur la manip. je vois déja une erreur de conception dans cette base. les info de manip sont descendante, c’est a dire que ca va depuis la conception de la manip a l’analyse des résultats. les liens entre ces parties devraient donc etre descendant aussi. or j’ai des lien ascendant entre la partie sample preparation et experiment design. j’ai surement besoin d’une entité entre les 2.
de plus la table des orf a besoin d’etre sortie de ce contexte car elle est indépendante des puces.
